Charakterisierung der 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase

Die HMG-CoA-Reduktase katalysiert die Umwandlung von HMG-CoA zu Mevalonat, was als geschwindigkeitsbestimmender Schritt in der Biosynthese von Cholesterin und anderen Zwischenprodukten des Mevalonat-Stoffwechselwegs bekannt ist. Das gereinigte Plasmid (pGEXtev/hmgr), das das Gen der humanen HMG-CoA-Reduktase enthält, wurde durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung bestätigt. Nach der Verifizierung wurde es in kompetente Zellen von Escherichia coli (BL21 und DH5¿) transformiert, wobei DH5¿ die vielversprechendsten Ergebnisse lieferte. Die Proteinexpression wurde mit IPTG induziert und durch Variation der Konzentration von IPTG, Betain und Sorbitol sowie durch Zugabe verschiedener Puffer weiter optimiert. Der Einfluss verschiedener Temperaturen auf die Proteinexpression wurde ebenfalls untersucht. Das Zielgen (hmgr) wurde in pET 22b subkloniert. Das subklonierte Plasmid pET22b/hmgr wurde in E. coli BL21 induziert, und seine Expression wurde durch den Einsatz unterschiedlicher IPTG-Konzentrationen und die Entnahme von Proben bei verschiedenen OD-Werten (A600) optimiert. Das Plasmid pGEXtev/hmgr in DH5¿ exprimiert ein Protein von 54 kDa zusammen mit einem GST-Fusions-Tag. Das Protein besteht aus 283 Aminosäuren, hat ein Molekulargewicht von 31,1 kDa und einen theoretischen isoelektrischen Punkt von 7,68.